高精料飲食通過上調STIM1/ORAI1引起奶牛乳腺組織的炎症、內質網應激和細胞凋亡
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研究背景
為了提高生產性能和經濟回報，奶牛經常被餵食大量的高精飼料（HC）。富含碳水化合物的高精飼料雖然能大大提高奶牛的產奶量，但同時也會影響奶牛的健康。高精飼料澱粉含量高，纖維含量低，當奶牛攝入過多的高精飼料時，揮發性脂肪酸（VFA）會在瘤胃內積累，導致瘤胃pH值降低，從而引起亞急性瘤胃酸中毒（SARA）。長期的SARA不僅降低了奶牛的採食量，還增加了奶牛發生蹄葉炎、肝膿腫和炎症反應的風險，嚴重危害奶牛健康，降低奶牛產奶量和牛奶質量，給乳業造成重大經濟損失。當發生SARA時，革蘭氏陰性菌在瘤胃中釋放大量的脂多糖（LPS），通過消化道的上皮屏障，轉移至循環系統，最終到達乳腺組織，引起乳腺組織的炎症反應，併產生大量的炎性細胞因子和急性期蛋白。
鈣離子（Ca2+）主要存在於細胞外和一些細胞器內，是細胞重要的第二信使。細胞內的Ca2+濃度通常在100~300nmol/L之間，顯著低於細胞外1~2mmol/L的水平。因此，維持細胞內鈣穩態對細胞的正常生長和生理功能至關重要。鈣庫操縱性鈣內流（SOCE）是非興奮性細胞Ca2+內流的重要方式，主要由基質相互作用分子1（STIM1）和Orai鈣釋放激活型鈣調節器1（ORAI1）組成。STIM1是位於內質網上的一種鈣傳感器，它可以將內質網Ca2+存儲耗盡的信號傳遞到質膜上的ORAI1，從而導致SOCE開放和Ca2+內流。當細胞內Ca2+含量升高時，蛋白激酶C（PKC）可被激活，從而激活調節蛋白激酶和核轉錄因子來調節炎症反應。細胞內Ca2+濃度的增加與細胞凋亡也有一定的關係。細胞外Ca2+的流入可破壞細胞內環境穩態，導致細胞內Ca2+超載，從而導致細胞凋亡。細胞內Ca2+水平的升高可能是由於細胞外Ca2+進入細胞所致，也可能是由於內質網釋放遊離Ca2+所致。內質網是細胞內Ca2+的儲存部位，在細胞中起著重要的生理作用。多種生理和病理條件可使內質網Ca2+消耗，引起細胞內鈣穩態失衡，從而導致內質網應激（ERS）。目前，關於STIM1/ORAI1功能的研究主要集中在其對各種惡性腫瘤和肺損傷的發生、進展和預後的影響上。然而，STIM1/ORAI1對SARA誘導的奶牛乳腺組織損傷的影響尚不清楚。
為此，南京農業大學沈向真教授團隊於Journal of Dairy Science雜誌中發表一篇名為A high-concentrate diet provokes inflammation, endoplasmic reticulum stress, and apoptosis in mammary tissue of dairy cows through the upregulation of STIM1/ORAI1的文章，旨在探討STIM1/ORAI1對HC飲食誘導的奶牛乳腺組織炎症、ERS和凋亡的調控作用。
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拓展閱讀
鈣庫操縱性鈣內流（SOCE）：其激活方式依賴細胞內鈣庫的耗竭。當細胞受到應激，內質網中的鈣庫耗盡時，位於細胞質的基質相互作用分子1（STIM1）作為Ca2+濃度感受器，通過感受自身Ca2+濃度耗竭而激活，隨後與位於細胞膜的Orai鈣釋放激活型鈣調節器1（ORAI1）偶聯激活形成Ca2+通道。作為非興奮細胞的一種基本Ca2+內流方式，SOCE參與調節細胞的諸多生理功能，如細胞分泌、基因轉錄、增殖、凋亡等。
蛋白激酶C（PKC）：PKC廣泛分佈於多種組織、器官和細胞，靜止細胞中PKC主要存在於胞漿中，當細胞受到刺激後，PKC以Ca2+依賴的形式從胞漿中移位到細胞膜上。細胞質中過量的Ca2+可與PKCθ相互作用來激活IKK，從而通過降解IκB的方式來活化NF-kB，進而誘導NF-κB轉位至細胞核中，促進炎症細胞因子的表達。過量的Ca2+還可以通過刺激PKCα，磷酸化NF-κB的Ser-536位點，導致炎症細胞因子的增加。
內質網應激（ERS）：是指當細胞受到氧化應激、能量障礙、代謝改變、炎症及 Ca2+紊亂等應激時，未摺疊蛋白和錯誤摺疊蛋白累積在內質網腔內而引發的一種反應。ERS會引發未摺疊蛋白反應(UPR)，通過調控下游相關基因的表達，來實現細胞內質網穩態的恢復或者誘導細胞的凋亡。IRE1α（肌醇需要酶1α）、PERK(蛋白激酶RNA樣內質網激酶)和ATF6（激活轉錄因子6）這三個膜轉運蛋白是UPR的三條支路。正常狀態下，它們與 ER 伴侶蛋白 GRP78（葡萄糖調節蛋白78）結合，處於靜止狀態。當 ER 處於應激狀態時，GRP78 的釋放會導致 ATF6 的裂解以及PERK和IRE1α的磷酸化，並分別啟動三條UPR支路。因此，GRP78的高表達可以作為ERS和UPR激活的標誌。
C/EBP 同源蛋白（CHOP）：關鍵的促凋亡轉錄因子，與內質網應激密切相關，在沒有刺激的情況下低水平表達。當細胞暴露於應激源時，CHOP的丰度上調。CHOP通過上調BH3蛋白（比如BAX）導致線粒體功能障礙和細胞凋亡，也能抑制抗凋亡基因Bcl-2的轉錄，破壞Bcl-2與促凋亡蛋白BAX之間的平衡，從而激活內源性凋亡。
實驗內容
01
瘤胃pH和血漿LPS檢測
將12頭體重相近的健康泌乳中期荷斯坦奶牛隨機分成以下2組：高精料組（HC）和低精料組（LC）。每天8點和17點餵食兩次，自由飲水，持續3周。造模結束後，對所有動物實施安樂死，採集瘤胃液、乳靜脈血液和乳腺組織樣本。使用pH儀檢測瘤胃液pH；使用LPS檢測試劑盒檢測血漿LPS濃度。結果顯示，HC組奶牛的瘤胃pH顯著低於LC組（P < 0.01），並且瘤胃pH值持續3h/d以上低於5.6，說明SARA模型被成功誘導（圖1A）。此外，HC組奶牛血漿LPS的濃度顯著高於LC組（P < 0.01；圖1B）。
圖1：飼餵HC對pH和LPS濃度的影響
02
HC飲食對SOCE通道的影響
SOCE通道主要由STIM1和ORAI1組成。在非興奮細胞中，SOCE通道主要是由高鈣水平介導的。當細胞受到應激，內質網中的鈣庫耗盡時，SOCE通道將被激活，導致細胞內Ca2+流入。因此，作者研究了HC飲食是否會影響SOCE通道。如圖2B所示，HC組奶牛乳腺組織中STIM1（P<0.01）和ORAI1（P<0.05）的mRNA表達水平顯著高於LC組奶牛。此外，與LC組奶牛相比，HC組奶牛乳腺組織中STIM1（P<0.05）ORAI1（P<0.01）的蛋白表達水平顯著上調。為了進一步證實我們的研究結果，我們測定了奶牛乳腺組織中Ca2+的含量。我們發現，與LC組奶牛相比，HC組奶牛乳腺組織中的Ca2+含量顯著增加（P<0.01；圖2A）。這些結果表明，SARA通過上調STIM1和ORAI1的基因以及蛋白表達來激活SOCE通道，從而導致Ca2+內流。
圖2：飼餵HC對SOCE通道的影響
03
HC飲食對IKK和PKC蛋白表達和酶活
性的影響
與LC飲食相比，HC飲食顯著提高了奶牛乳腺組織中IKK（P<0.01；圖3A）和PKC（P<0.01；圖3B）的激酶活性。此外，HC組奶牛乳腺組織中IKK-β（P<0.05）和PKC-α（P<0.01）的蛋白表達量顯著高於LC組（圖3C和D）。
圖3：飼餵HC對IKK和PKC蛋白表達以及激酶活性的影響
04
HC飲食對奶牛乳腺組織中NF-кB通路
的影響
如圖4A-C所示，與LC飲食相比，HC飲食增加了IL-1β、IL-6和TNF-α的濃度（P<0.01）。圖4D-F顯示了參與炎症反應的基因表達。與LC飲食相比，HC飲食奶牛的乳腺組織中急性期蛋白LBP（P<0.01）、HP（P<0.01）和SAA3（P<0.05）的mRNA表達水平顯著上調（圖4E）。此外，與LC組相比，HC組奶牛的乳腺組織中RELA（P<0.05）、IKBA（P<0.01）、IL6（P<0.05）、IL8（P<0.05）、IL1A（P<0.01）、IL1B（P<0.01）、TNFA（P<0.01）的mRNA表達顯著升高，而IL10（P<0.05）的mRNA表達顯著降低（圖4D和圖4F）。HC組奶牛乳腺組織的p-IκBα（p<0.05）、p-p65（p<0.01）、IL-1α（P<0.01）、IL-1β（P<0.01）和TNF-α（P<0.01）的蛋白表達均顯著高於LC組，並且HC組中p-IκBα和IκBα（P<0.05）以及p-p65和p65（P<0.01）的比值均顯著增加（圖4G-J）。這些結果表明，HC飲食激活了NF-κB通路，並上調了炎症因子的表達。
圖4：飼餵HC對奶牛乳腺組織中NF-кB通路的影響
05
HC飲食對奶牛乳腺組織ERS的影響
如圖5A所示，與LC組奶牛相比，HC組奶牛乳腺組織中GRP78（P<0.01）、CHOP（P<0.05）、IRE1A（P<0.05）、ATF6（P<0.05）、PERK（P<0.05）的mRNA表達水平顯著升高。如圖5B-D所示，與LC組奶牛相比，HC組奶牛乳腺組織中PERK（P<0.05）、p-PERK（P<0.01）、ATF6（P<0.05）、IRE1α（P<0.01）、p-IRE1α（P<0.01）、GRP78（P<0.01）、CHOP（P<0.05）的蛋白表達水平顯著升高。HC飲食顯著上調ERS標記分子的表達，說明HC飲食可誘導奶牛乳腺組織的ERS。CHOP是一種促凋亡的轉錄因子，HC飲食可上調CHOP的mRNA和蛋白表達水平。因此，我們進行了以下研究，探討HC飲食是否會促進奶牛乳腺組織凋亡。
圖5：飼餵HC對奶牛乳腺組織ERS的影響
06
HC飲食對奶牛乳腺組織凋亡的影響
如圖6A所示，與LC組奶牛相比，HC組奶牛乳腺組織中Caspase-3（P<0.05）、Caspase-9（P<0.05）和BAX（P<0.01）的mRNA表達均顯著升高，而BCL-2的mRNA表達顯著降低（P<0.05）。如圖6B所示，HC組乳腺組織中Caspase-3（P<0.01）和Caspase-9（P<0.01）的酶活性均高於LC組，Caspase-8沒有差異（P>0.05） 。如圖6C和D所示，HC組奶牛乳腺組織中Caspase-3（P<0.05）、Cleaved-Caspase-3（P<0.05）、Caspase-9（P<0.01）和BAX（P<0.01）的蛋白表達顯著高於LC組，BCL-2（P<0.01）的蛋白表達顯著低於LC組。研究結果表明，HC飲食通過上調促凋亡蛋白和下調抗凋亡蛋白來誘導奶牛乳腺組織的凋亡。
圖6：飼餵HC對奶牛乳腺組織凋亡的影響
07
7. 乳腺的組織病理學分析
免疫組化結果顯示，HC飲食顯著增加了奶牛乳腺組織中STIM1（P<0.01）、ORAI1（P<0.01）、GRP78（P<0.01）和Caspase-9（P<0.01）的表達。
圖7：LC組和HC組奶牛乳腺組織的免疫組化染色
總結
飼餵HC顯著降低了奶牛瘤胃pH，提高了乳靜脈血中LPS水平。LPS通過上調STIM1和ORAI1的表達來激活SOCE通道，增加乳腺組織中的Ca2+含量以及IKK和PKC的激酶活性，進而誘導NF-κB信號通路的激活和炎症細胞因子的產生，導致奶牛乳腺組織的炎症反應。此外，飼餵HC會導致奶牛乳腺組織的ERS和細胞凋亡，從而引起奶牛乳腺組織損傷。這些結果為飼餵HC導致的奶牛乳腺炎的分子機制提供了一個新視角。SOCE信號通路對乳腺組織炎症、ERS和凋亡的影響有待在細胞實驗中進一步驗證。
翻譯 I趙晨晨碩士生
主審 I 楊宇宸博士生
複審 I 杜希良副教授 劉愷博士生
編輯 I 陳俊碩士生
吉林大學奶牛營養代謝病研究創新團隊
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